菌液pcr筛选有目的条带酶切验证条带大小不正确

我也遇到过这种问题,个人觉得可能是目的基因的定量引物不好,还有就是要优化PCR条件!

建议：循环次数减少3,Mg离子浓度降低到1.2mm,提高annealing的温度

如果实验目的只是基因型鉴定,对PCR产物无其他要求的话,二聚体并非不能忍受,可以尝试以下方法优化反应条件：1.确定DNA模板为阳性,即确定含有目标序列；2.对退火温度设置温度梯度,琼脂糖电泳检测是否有

存在两种可能性,第一,引物设计错误,可以将引物和参考序列进行拼接后看看能不能顺利拼接,以及拼接之后的目的片段长度；第二,可能是非特异扩增,这个时侯如果确定引物位置没有问题,可以调整退火温度,以及PCR

在PCR的优化开始阶段,应用新的DNA模板,引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法,其扩增效果一般总不是最佳的.这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的DNA产物的产率.表1

如果PCR系统没有问题,很可能是质粒和染色体发生了重组.建议提细菌的genomeDNA做一次PCR.如果是阳性,就说明是这样.另外,还可以另挑几个菌落,重新提质粒扩增.

我觉得用elutionbuffer没太大的影响,如果你非要觉得不好的话,只能在转化一遍重新提质粒或者抽成干粉再加水.我们一般用水就行.实在不行去测序呀.提的质粒和空质粒可以比较,如果你插入的基因足够大

可以照胶的时候去调节亮度,对比和γ射线,然后会清楚一些.同时,你优化下PCR扩增条件之类的,提高扩增效率.希望对你有帮助.望采纳.再问：感谢回答，我会试试调节亮度。请问，这跟电泳时使用的染色液有关系吗

高手们好.最近做酶切连接转化,最后做鉴定时,以菌落为模板进行PCR时可以见到有目的条带；当把菌落接种到LB液扩菌后,以菌液为模板进行PCR时却什么东东都没有?请问会是什么原因啊?多多指教啊!建议重新以

就只是你的目的基因菌液PCR扩增不出来么?不过我觉得你如果质粒、电泳、菌落PCR都能验证的话,菌液PCR结果如何都意义不大了.

能确定菌液pcr出来的就是目的条带吗?如果确定,那就是可能质粒抽提和酶切这两步出了问题

菌落PCR的假阳性高很可能是因为你做PCR的循环数过大,我们实验室一般对于高拷贝数的质粒,循环数不会超过25个,一般用25个.我知道一家做这些,[威斯腾生物].感觉还可以

问题很多啊.或者是你的PCR仪需要进行荧光校准（如果其他探针也没有信号的话）,已经不能收集荧光信号了.或者是你的探针本身就有问题,合成的不好,信号很弱甚至没有信号.或者是你的探针存放时间太长,存放条件

一个可能原因,DNA结合了蛋白质,所以跑不出去.加loadingbuffer后加热（90度以上）一下再上样试试.另外一个原因,你的产物特别大（不一定是目标产物）再问：我做的是菌落PCR电泳检测结果，我

我本人没具体做过信息学,有个师弟以前做过,就我薄弱的了解,我觉得其实你自己想的方法已经是正道了.由于你现在是时间有限,虽然你调高SAM参数有可能漏掉关键基因,但应该会缩小目的基因范围.用GO分析也是个

恐怕还是cDNA的问题,actin因为量比较丰富,所以即使破坏一些仍能P出来,但你的目的基因就不同了

有很多影响因素：模板浓度,引物浓度,酶在反应过程中的不断消耗,循环数和温度等等.如果你已经P出来目的片段的话温度应该是适合的,可以加大模板和引物的量,建议回收片段后作为模板再P,这样得到的片段会较亮.

酶切位点消失啦,测个序看看.再问：测序了，说我的链接质粒没有信号再答：重新做吧，多半不对！

可能是里面有带抗性的质粒,但是这个质粒上并没有插入你要的片段哦

PCR扩增的结果和模板的质量有直接的关系,在PCR扩增中如果模板纯度高,很低的量都可以进行扩增的.提取细菌的DNA量不多但纯度高,即使DNA电泳检测不到条带,PCR仍然能扩出条带.希望你看明白了.