什么是微生物培养技术?

什么是微生物培养技术?

“微生物的利用”包括“进行微生物的分离和培养”、“测定某种微生物的数量”、“研究培养基对微生物的选择作用”和“尝试利用微生物进行发酵来生产特定的产物”四项具体内容标准,按照相关内容标准的要求,结合人教版教材所对应的实验课题,本文将谈谈对本专题的教学组织.

1 习得微生物培养的基础知识和基本技能

本专题涉及三个实验课题,它们的关系及学习要求如下图所示.在下图中,课题1涉及微生物培养的基础知识和基本的操作技能,是其他两个课题的基础,课题2和课题3涉及特定的微生物的分离、计数和鉴定,难度较大,课题2强调选择性培养基的配制和作用,课题3是在选择性培养基的基础上,又相应地增加了鉴别性培养基的知识及其应用.


1.1 配制微生物培养基 配制培养基的基础知识是培养、观察和研究微生物的基础.教学时,可以先展示有菌落生长的培养基平板,给学生以视觉刺激,让他们体会到要观察和研究微生物,必须创设一定的条件让微生物大量快速地繁殖起来,只有形成具有一定特征的菌落,才能更好地研究微生物.进而向学生提供几种微生物培养基的配方,让学生通过比较分析各种配养基配方,明确微生物培养基的基本成分包括：碳源、氮源、无机盐和水,有些微生物还需要某些特殊的生长因子.然后,依次阐明固体、半固体和液体培养基的用途和配制方法,并结合下面的流程图概述培养基配制的操作步骤：


组织学生配制微生物培养基时,要向他们讲清下列注意事项：（1）溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌,以免培养基溢出或烧焦；（2）加热过程中部分水分蒸发,待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水,以保持溶液的浓度；（3）分装至试管时培养基的高度不要超过试管高度的1/5；（4）一般是培养基先灭菌再倒平板,也可先倒平板,课间再灭菌；（5）冷却后的平板要倒置,以确保拿放方便,同时避免水分蒸发,以利微生物生长.

1.2 无菌技术操作无菌技术是培养、分离和纯化微生物的重要技术手段,也是植物组织培养的关键性操作.教学时,要先让学生正确区分消毒和灭菌这两个概念,并充分认识无菌操作的重要性；然后,在教师的组织和指导下进行规范、熟练地操作,以便顺利完成微生物的培养、分离和纯化等实验.下表是消毒和灭菌的一些常用方法及使用范围.

定义
常用方法
微生物培养和组培的应用

消毒
使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分菌体,但不伤及活组织
煮沸
玻璃仪器

紫外线
实验室、操作台、衣物等

酒精溶液
手、外植体等

次氯酸钠溶液等
外植体

灭菌
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有菌体、芽孢和孢子
高压蒸汽
培养基、玻璃仪器、棉塞、牛皮纸等

灼烧
接种环、涂布器等

干热
玻璃仪器



1.2.1 接种的方法及作用 微生物接种方法有两种,一是划线接种,即用接种环划线将菌体沾在斜面培养基或平板培养基上.微生物的生长和繁殖迅速,一段时间后,就会在培养基表面形成长满菌落的细线.划线法的作用是纯化微生物,通过划线将微生物单个地分离,并最终形成标准的菌落；二是涂布接种,即用涂布器将稀释菌液均匀地涂布在平板上.一个菌体在培养基平板上形成一个菌落,通过统计菌落数可以计算样品中的菌体数目.

1.2.2 规范实验操作 接种过程的无菌操作是微生物实验的关键环节,右图为划线接种的操作示意图,下表列出划线接种的基本步骤和说明.教学中,要求学生认真领会无菌接种的技术原理,反复练习操步骤作.通过练习达到熟练程度,并培养严谨认真的科学精神和一丝不苟的实验态度.

序列
操作步骤
分析说明

1
将接种环放在火焰上灼烧,直到接种环烧红
将接种环灭菌,避免污染菌种

2
在火焰旁冷却接种环,拔除盛有菌液的试管棉塞
避免杂菌污染菌种

3
将试管口通过火焰
灼烧灭菌,防止试管口菌体污染培养基

4
将已冷却的接种环伸入菌液中,沾取菌液
冷却接种环可避免杀死菌种

5
将试管口通过火焰,并塞上棉塞
避免试管口杂菌污染菌种

6
左手将皿盖打开一条缝隙,右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内,划三至五条平行线,盖上皿盖.注意不要划破培养基
初步接种.划破培养基不利于后续的继续划线,长出的菌落不标准

7
灼烧接种环,冷却后从第一区划线的末端向第二区划线.重复以上操作,在第三、四、五区划线.注意不要将最后一区的划线与第一区相连
从上个区域的末端向下个区域划线,可逐步分离出单个菌体,从而实现微生物的纯化

8
将平板倒置,放入培养箱中培养
倒置平板防止水分蒸发,也方便拿放



1.3 稀释菌液的意义和操作方法 在单位体积的菌体培养液内,含有的微生物个体数目很多.要对微生物进行分离和计数必须将菌液稀释,只有在稀释度足够高的菌液里,聚集的微生物才能分散成单个细胞.一般将菌液稀释到10-3～10-7时,接种后可能在培养基平板上形成30～300个左右的菌落,统计的菌落数也比较准确可信.

用移液管和无菌水稀释微生物菌液是一件要求较高的操作技术,学生需要经过多次练习才能做到尽量地减少误差. 以土壤为样品进行稀释操作的注意事项是：（1）初次称量的土壤样品,稀释后的菌液浓度较大,移液时极容易堵塞移液管或吸入较多的土壤颗粒,应静置一段时间后再移液,或者用低速离心机离心1分钟后进行移液；（2）当稀释倍数大时,在稀释前一定要震荡试管,充分混合菌液,保证移液操作的准确性；（3）每次移液前一定要注意用无菌水（或蒸馏水）清洗移液管并用气球吹干,以保证移走菌液的浓度与试管中的一致.

2.实验设计能力的训练

2.1 选择性培养基的实验设计 根据功能的不同,培养基分为选择性

培养基和鉴别性培养基,在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验中,先让学生通过分析和判断下面的三个培养基配方,真正理解选择性培养基的含义.然后,启发学生设计一组用于分离尿素细菌的探究实验,帮助学生理解选择性培养基的特性及作用.


组别
培养基类型
是否涂布接种
目的

实验组
以尿素为唯一氮源的培养基
是
分离尿素细菌

对照组
牛肉膏、蛋白胨培养基
是
判断该培养基有无选择性









2.2 鉴别性培养基的实验设计 在“分解纤维素的微生物的分离”实验中,要鉴别筛选出来的微生物是不是分解纤维素的微生物,就必须用鉴别性培养基.刚果红与纤维素等多糖类物质反应形成红色复合物,添加刚果红的培养基呈红色,接种的微生物若能够分解纤维素,就会在其菌落的周围形成透明圈.值得注意的,培养基的琼脂中含有淀粉类物质,产生淀粉酶的微生物在培养基上也会形成透明圈；也有些微生物具有降解刚果红的能力,培养时间过长,也会在菌落周围出现透明圈.与分解纤维素形成的透明圈相比,这两种透明圈小而模糊,因此,本实验最好先用选择性培养基筛选分解纤维素的微生物,再配制鉴别性培养基进行“分解纤维素的微生物的分离”的实验.

3 教学实施的前期准备

3.1提前准备好实验仪器、设备和药品 为方便大家提前做好准备,现以人教版教材为例,将本专题所需要的仪器、设备和药品列表如下：

课题名称
实验仪器和设备
实验试剂或药品
说明

微生物的实验室培养
培养皿、试管、锥形瓶、量筒、酒精灯、电子天秤、高压蒸汽灭菌锅、移液管、接种环、涂布器、恒温箱、干热灭菌箱、小铁铲等


牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、琼脂等
干热灭菌箱能够迅速地将洗干净的培养皿和试管烘干,小铁铲用于铲土

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
除配制牛肉膏蛋白胨培养基所需物质外,增加KH2PO4 、NaHPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、酚红等

分解纤维素的微生物的分离
除配制牛肉膏蛋白胨培养基所需物质外,增加纤维素、NaNO3、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、KCl、酵母膏、水解酪素、CMC-Na(羧甲基纤维素钠)、土豆汁、刚果红等


3.2 做好课时安排及计划 以下为本专题的三个课题的课题数及其说明.

课题名称
课时数
说明

微生物的实验室培养
4
配养基的基本知识及配制方法1；配制培养基及倒平板1；纯化大肠杆菌和涂布接种1,观察分析1

分离土壤中分解尿素的细菌
3
基本原理及实验设计1；样品稀释及涂布接种1；对菌落进行统计及实验的分析与讨论1；在第二和第三课时之间需要间隔2天时间

分解纤维素的微生物的分离
3
基本原理及实验设计1；样品稀释及涂布接种1；对菌落进行统计及实验的分析与讨论1；在第二和第三课时之间需要间隔2天时间



3.3 安排好教学班的实验顺序 微生物实验涉及较多的实验仪器,而且实验时需要课内和课外相结合,如实验室培养需要学生在课堂上完成两项重要的操作步骤,一是配制培养基并倒平板；二是接种操作.平板灭菌工作由于需要较长的时间,因此只能由教师在课间完成.为保证每位学生都能亲手操作,保证各个教学班能在有限时间内完成实验任务,教师可采取如下的教学流程和教学安排.


3.4 做好课后的观察与记录 配制培养基和接种操作可以在课堂上完成,但接种后的平板放入培养箱中需要培养2～3天,这期间可安排生物科代表或部分小组长进行定期观察,并做好计录,以便及时让其他学生观察到自己的实验成果.特别需要说明的是,如果学生不能及时观察,培养的时间过长,很多菌落就会联成一片,计数时就无法做到准确有效.

4.实验中需要注意的安全操作

微生物本身就是危险生物,实验操作中又涉及到消毒、灭菌和接种等基本环节,因此要对学生进行安全教育,确保学生的安全和实验的顺利进行.一是操作安全,接种时要注意避免手被酒精灯火焰灼伤,接种后要及时提配学生洗手,以防止被微生物感染；二是环境安全,使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理,以免污染环境.