如何从基因水平蛋白质水平及生物学活性等方面检测t细胞受抗原刺激后所产生的il

如何从基因水平蛋白质水平及生物学活性等方面检测t细胞受抗原刺激后所产生的il

【摘要】 用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原,紫外光谱鉴定偶联效果,计算偶联率.利用免疫抗原免疫小鼠,制备小鼠多克隆抗体,用检测抗原分析血清抗体效价,利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性,为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础. 【关键词】 雷公藤内酯醇； 14位羟基修饰； 人工抗原； 多克隆抗体 雷公藤内酯醇（triptolide,TP）分子式C20H24O6,分子结构如图1,相对分子质量360.41,为二萜类三环氧内酯化合物,是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分,具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效.长期以来,TP作为临床上公认的免疫抑制剂,主要用于各种自身免疫性疾病,如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗.近年来研究发现,该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用,与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药,说明它具有抗肿瘤效果,因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注.除此以外,它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用.近年来,国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣,从多个不同的角度进行了研究.但是,由于缺少方便快捷的TP检测手段,长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难,对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少.细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具,如果能够得到TP的抗体,就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针,为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能.作为小分子半抗原,TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原.为了不影响小分子的生物活性,提高偶联效率,我们需要选择合适的反应基团.已有的TP结构 活性研究显示,TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团.研究证实,对于12,13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇（triptriolide）会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性.14位羟基是TP最容易被改造修饰的基团,研究表明,14位羟基被改造为水溶性的基团作为前药能极大改善小分子的水溶性,促进体内代谢,降低毒性,甚至能改善TP在体内的免疫抑制活性和抗肿瘤活性［1 2］. 综合考虑,TP的14位羟基是最合适的偶联基团.TP的水溶性不理想,且14位羟基不容易在温和条件下和蛋白载体反应,我们首先对14位羟基进行结构修饰,改造为水溶性的羧基,利用缩合反应偶联阳离子化牛血清白蛋白（cationized BSA,cBSA）和鸡卵清蛋白（OVA）,合成TP的免疫抗原TP cBSA和检测抗原TP OVA.用免疫抗原免疫小鼠,顺利得到了TP的多抗. 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 TP（购自SIGMA公司）,cBSA（购自PIERCE公司）,OVA,1 乙基 （3 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）,福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂(FIA),6～8周龄BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学中心）,Sephadex凝胶柱（购自PIERCE）.TP、OVA、1 乙基 （3 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂（FIA）均购自Sigma公司,cBSA、Sephadex凝胶柱均购自PIERCE公司,6～8周龄BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心. 岛津UV 2550紫外可见分光光度计,Eppendorf Centrifuge 5415R离心机,TECAN SAFIRE自动酶标仪. 1.2 TP 14位羟基的修饰以及修饰产物的质谱鉴定 将TP的14位羟基进行衍生化修饰,在弱碱性条件下和丁二酸酐进行酰化反应,反应式如图2所示,得到水溶性分子triptolide 14 succinate（mTP）,用质谱鉴定反应产物. 1.3 TP人工抗原的制备 碳二亚胺（EDC）法偶联mTP与蛋白载体（以cBSA为例,OVA合成的方法类似）： 取5 mg mTP和2.5 mg cBSA溶解在250 μl TE buffer（pH 8.0）中,充分震荡使其溶解,再取EDC·HCl 79 mg充分溶解于250 μl TE buffer（pH 8.0）中.将mTP和cBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液,在37 ℃摇床中反应2 h以上.先用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的mTP小分子,再透析纯化,将0.5 ml 溶液在PBS中透析3 d,每天换液两次,每次换液200 ml.透析产物小剂量分装,于－20 ℃保存备用. 1.4 人工合成抗原的紫外鉴定 用紫外分光光度法对cBSA标准品、偶联产物和mTP进行紫外扫描,根据偶联产物最大吸收峰的位移判断是否偶联成功. 1.5 人工合成抗原偶联率的计算 紫外扫描结果显示,蛋白载体最大吸收峰的位置在280 nm,mTP最大吸收峰在261 nm,偶联产物这两个波长的紫外吸收强度包括了蛋白载体和mTP的贡献.人工合成抗原的摩尔偶联率CmTP/CBSA可由以下公式计算得出： CmTP/CBSA=(A280×KBSA,261－A261×KBSA,280)/(A261×KmTP,280－A280×KmTP,261) 其中A280、A261分别为偶联产物在波长为280 nm和261 nm时的紫外吸光度,KBSA,280、KBSA,261、KmTP,280、KmTP,261分别对应BSA和mTP在波长为280 nm和261 nm的摩尔消光系数［3］. 1.6 TP人工抗原多抗血清的制备及鉴定 初次免疫：将100 μg 人工抗原与等体积FCA乳化完全,皮下分点注射4只BALB/c小鼠；2次免疫：初次免疫后两周将100 μg 人工抗原与等体积FIA乳化完全,皮下分点注射BALB/c小鼠；3次免疫：两周后将150 μg 人工抗原皮下分点注射BALB/c小鼠；第3次免疫两周后,以200 μg人工抗原经腹腔加强免疫血清效价较高的小鼠.尾部采血分离抗血清,以制备的检测抗原OVA mTP包被ELISA板,采用间接ELISA法检测血清抗体的效价.为了验证血清中TP抗体的特异性反应,我们用偶联好的OVA mTP包被酶标板,再用不同浓度的TP、雷公藤内酯三醇（图3）和冬凌草甲素（oridonin）间接竞争ELISA法检测血清中抗体特异性.以TP为例,竞争ELISA方法如下：取OVA mTP于37 ℃,2 h包被酶标板（每孔100 μl）,10 %羊血清封闭后PBST洗3次,每孔加入50 μl TP,浓度分别为1、2、5、8、10、30、50 ng·μl－1和50 μl稀释的血清,混匀后37 ℃反应1 h,PBST洗3次,加入酶标二抗37 ℃反应1 h,洗3次,每孔加显色液150 μl,反应15 min,2 mol·L－1硫酸终止反应后,用酶标仪测450 nm吸收值,每孔测4次,取平均值,建立竞争抑制曲线. 2 结果和讨论 2.1 mTP的质谱鉴定 mTP质谱如图4,相对分子质量为440和540的峰分别对应TP和mTP各自与溶剂吡啶形成的离子 图3 雷公藤内酯三醇结构 Fig 3 Triptriolide structure峰.虽然产物mTP中还含有一部分反应原料TP,但是TP无法与蛋白载体在EDC存在条件下进行缩合反应,因此这部分TP并不会对人工抗原的合成造成干扰,我们无需对mTP进行提纯以除去TP. 2.2 TP人工抗原的紫外鉴定和偶联率 阳离子化的牛血清白蛋白载体cBSA的氨基数量远多于羧基,一方面能够提高偶联效率,另一方面提高了BSA的等电点,使得蛋白在反应体系的pH下溶解度大大改善.偶联产物的紫外光谱见图5,偶联产物的最大吸收峰相比蛋白载体向左明显偏移,由280 nm到了269 nm左右,显示偶联成功.偶联产物在280 nm和261 nm的紫外吸光值分别是3.029和3.058,由公式可计算得出mTP和蛋白载体cBSA的摩尔比为65∶1,偶联效率较高. 2.3 多抗血清的效价和抗体特异性反应 第3次免疫两周后,用间接ELISA法测定小鼠血清抗体效价为1∶102 400,TP、雷公藤内酯三醇和冬凌草甲素的间接竞争ELISA实验表明,TP及其衍生物雷公藤内酯三醇均能产生竞争作用,而冬凌草甲素不显示竞争关系,证明血清中多抗能在很大程度上与TP及其衍生物雷公藤内酯三醇反应,而完全不能与同为二萜类化合物的冬凌草甲素结合.与TP相比,雷公藤内酯三醇仅仅是12,13位的环氧基团打开,其它结构完全一致,能被多抗识别是可以理解的,但从竞争曲线上看来,TP的竞争饱和吸光值要低于雷公藤内酯三醇,从一定程度上证明多抗与TP的结合能力强于雷公藤内酯三醇,提示多抗中存在着识别TP 12,13位环氧基团的特异性抗体.冬凌草甲素是一种中药提取物,也具有抗肿瘤、消炎止痛等功效,与TP同为二萜类化合物,具有类似的相对分子质量,分子为四环结构,无环氧内酯,不能产生竞争作用,证明多抗对TP系列分子结构的特异性识别.以浓度为横坐标、OD450值为纵坐标,竞争抑制曲线如图6所示. 从TP的竞争抑制曲线上看,在0～8 ng·μl－1的浓度区间内,OD450和TP的浓度呈一定的线性关系,暗示可以通过ELISA方法进行TP的定量.现有的TP HPLC定量法灵敏度和重复性很好,可是设备昂贵,样品预处理麻烦,检测定量成本高［4］.与之相比,ELISA定量更加方便高效,可以批量处理样品,节约成本,在灵敏度上也绝对满足要求.ELISA定量检测TP是个很有前景的方法. TP在抗炎、免疫抑制等方面的功用早已得到证实,杨远等［5］发现TP抑制哮喘患者外周血单核细胞中IL 4在mRNA水平的表达,其在抗肿瘤方面的活性也有很多研究报道.近年来,通过对TP结构修饰研究其分子结构和基团对生物活性的影响已经取得了一定的进展.从TP的分子结构来看,它含有3个环氧基团和1个五元不饱和内酯环,这些基团在一定条件下将会发生反应.其主要功能基团包括14位羟基,（9,11）位、（12,13）位和（7,8）位3个环氧基,（3,4）位双键以及1个内酯环.已有的TP结构 活性研究显示,TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团.从分子模型上看,12,13位环氧空间位阻较另两个环氧基团小,易受亲核试剂攻击,它的存在是TP具有生物活性的主要原因.研究证实,对于12,13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性.此外,通过对雷公藤中一系列与TP结构类似二萜类化合物的初步药理研究表明,2位的氢被羟基所取代,将降低化合物的抗炎、抗肿瘤和免疫抑制活性,但会使抗生育活性和毒性有所增加.而将TP的5位添加一个羟基后形成的衍生物,其具有一定的T细胞增殖和活化抑制作用,但它的毒副作用则降低了122倍（体外实验）和10倍（体内实验）,这说明TP 5位的氢与TP对其它组织器官的生物活性密切关联［2］.对TP及其衍生物各种生物活性的分子机理方面,近年来也有越来越多的研究报道,其中对免疫抑制作用的报道主要集中于对各种免疫细胞的影响,TP体外实验证实,其对T细胞及B细胞均有影响,且可明显抑制有丝分裂原刺激的淋巴细胞增生反应,诱导活化的淋巴细胞发生凋亡,同时还通过抑制淋巴细胞NF κB 的活力而减少多种促炎因子(如IL 1,TNF α等) 及细胞因子的产生［6 9］.TP可通过PI3K/Akt以及NF κB途径影响对DC细胞迁移［10］.然而,对于其小分子作用靶点的定位究竟在细胞膜、细胞质还是细胞核中,其作用的靶蛋白究竟有哪些,TP是如何通过其靶蛋白发挥生物活性等的分子机制研究尚处于探讨之中.Stephanie等[11]通过3H标记TP,发现TP与细胞的结合是可饱和、可逆的并且大部分结合在细胞膜上,且3H标记的TP只能与完整的细胞结合,而不能与细胞裂解液的任何一个组分结合.Christine及其同事［12］也通过类似的研究发现TP与细胞核成分结合,可特异性、不可逆地与单核细胞和上皮细胞中一个90 kD的核抽提蛋白结合.所以,TP的作用方式到底是怎样的?其靶点究竟有那些?以上这两个互为矛盾的研究结果并不能对此给出明确的答案.通过制备TP的抗体,就可以提供一个有效的手段和工具通过免疫荧光方法研究确定TP在细胞内的定位,通过激光共聚焦荧光显微镜观察其在细胞内作用过程,也为通过免疫共沉淀等方法寻找TP的分子靶点,以揭示其分子机理创造条件. 另外,本研究中TP多克隆抗体的成功制备也为我们进一步制备其单克隆抗体奠定了基础.与多克隆抗体相比,单克隆抗体对于进行TP作用机制方面的研究具有更多的优点,并且单克隆抗体也可以为TP提供新的定量方法,甚至为研究其在体内的代谢和分布创造条件.本研究通过选择TP的14位羟基作为反应基团,先用丁二酸酐将羟基修饰为羧基,然后和cBSA、OVA偶联,偶联率达到了65∶1.藉此方法,本研究成功制备了多克隆抗体,制备的多抗血清效价达到了106以上,竞争ELISA曲线表明此多抗对TP家族分子有特异性反应,且TP与雷公藤内酯三醇的竞争曲线不尽相同.以上结果暗示,我们通过制备其单克隆抗体,不仅可以筛选到识别TP家族的单克隆抗体,还有可能进一步筛选到能够特异性区分TP与雷公藤内酯三醇的单克隆抗体,为雷公藤单体作用机理及其定量分析研究创造条件.