大师作文网如何用邻苯三酚法测定超氧化物岐化酶的活性?
来源：学生作业帮 编辑：大师作文网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/11/18 06:12:26
如何用邻苯三酚法测定超氧化物岐化酶的活性?
要用到的试剂,仪器
要用到的试剂,仪器
[原理]
SOD的活力测定方法很多,常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法.其中化学法应用最普遍,化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -,利用SOD分解而间接推算酶活力.在化学方法中,最常用的有黄嘌呤氧化酶法,邻苯三酚法,化学发光法,肾上腺素法,NBT-还原法,光化学扩增法,Cyte还原法等.其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用.化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD,但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏.Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定,重复性好.但专一性和灵敏度不够理想,而且需要特殊仪器,实际应用受到限制.亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合,应用于Mn-SOD测定,灵敏度比Cyte还原法提高数倍,而且专一性强,重复性好,操作方便,不需要特殊仪器和设备,易于实际应用和推广,是目前较好的测定方法之一.
在一般情况下,SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法.本实验采用邻苯三酚自氧化方法.
邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2 -,生成带色的中间产物,反应开始后反应液先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是因为生成的中间物不断氧化的结果.这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段,中间物的积累在滞留30～45s后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内,中间物在420nm波长出有强烈光吸收.当有SOD存在时,由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过计算即可求出SOD的酶活性.
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下,每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位.
[试剂和器材]
1、试剂
（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
称取Tris 0.61g,EDTA-2Na 0.037g,用双蒸水溶解至80mL左右,用HCl调节pH =8.20（用pH计校正）,最后定容至100mL.
（2）10mmol/L HCl
（3）50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g,用10mmol/L HCl溶液溶解,定容至10mL,避光保存.
（4）SOD样液
2、器材
（1）恒温水浴槽
（2）紫外分光光度计
（3）试管、刻度吸管、微量注射器
[方法和步骤]
1、邻苯三酚自氧化速率的测定
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚 ）,迅速摇匀,立即倾入1cm比色杯中,在325nm波长处测定光吸收值,每隔30s读数一次,测定4min内每分钟光吸收值的变化.要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量,以控制光吸收值）.
试剂 空白管（mL） 自氧化管（mL）
pH8.2、50mmol/L
Tris-HCl 2.98 2.98
10mmol/L HCl 0.02 0.01
50 mmol/L邻苯三酚 - 0.01
2、SOD样液的活性测定
样品管取代自氧化管.样品管测定时先加入预热的待测酶液,再加邻苯三酚.其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定.
试剂 空白管（mL） 样品管（mL）
pH8.2、50mmol/L
Tris-HCl 2.98 2.98
10mmol/L HCl 0.02 -
SOD样液 - 0.01
50 mmol/L邻苯三酚 - 0.01
（3）计算
SOD的活力测定方法很多,常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法.其中化学法应用最普遍,化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -,利用SOD分解而间接推算酶活力.在化学方法中,最常用的有黄嘌呤氧化酶法,邻苯三酚法,化学发光法,肾上腺素法,NBT-还原法,光化学扩增法,Cyte还原法等.其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用.化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD,但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏.Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定,重复性好.但专一性和灵敏度不够理想,而且需要特殊仪器,实际应用受到限制.亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合,应用于Mn-SOD测定,灵敏度比Cyte还原法提高数倍,而且专一性强,重复性好,操作方便,不需要特殊仪器和设备,易于实际应用和推广,是目前较好的测定方法之一.
在一般情况下,SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法.本实验采用邻苯三酚自氧化方法.
邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2 -,生成带色的中间产物,反应开始后反应液先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是因为生成的中间物不断氧化的结果.这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段,中间物的积累在滞留30～45s后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内,中间物在420nm波长出有强烈光吸收.当有SOD存在时,由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过计算即可求出SOD的酶活性.
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下,每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位.
[试剂和器材]
1、试剂
（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
称取Tris 0.61g,EDTA-2Na 0.037g,用双蒸水溶解至80mL左右,用HCl调节pH =8.20（用pH计校正）,最后定容至100mL.
（2）10mmol/L HCl
（3）50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g,用10mmol/L HCl溶液溶解,定容至10mL,避光保存.
（4）SOD样液
2、器材
（1）恒温水浴槽
（2）紫外分光光度计
（3）试管、刻度吸管、微量注射器
[方法和步骤]
1、邻苯三酚自氧化速率的测定
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚 ）,迅速摇匀,立即倾入1cm比色杯中,在325nm波长处测定光吸收值,每隔30s读数一次,测定4min内每分钟光吸收值的变化.要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量,以控制光吸收值）.
试剂 空白管（mL） 自氧化管（mL）
pH8.2、50mmol/L
Tris-HCl 2.98 2.98
10mmol/L HCl 0.02 0.01
50 mmol/L邻苯三酚 - 0.01
2、SOD样液的活性测定
样品管取代自氧化管.样品管测定时先加入预热的待测酶液,再加邻苯三酚.其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定.
试剂 空白管（mL） 样品管（mL）
pH8.2、50mmol/L
Tris-HCl 2.98 2.98
10mmol/L HCl 0.02 -
SOD样液 - 0.01
50 mmol/L邻苯三酚 - 0.01
（3）计算