大师作文网细胞培养与组织培养的区别
来源：学生作业帮 编辑：大师作文网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/11/17 22:54:18
细胞培养与组织培养的区别
组织培养(Tissue culture)是在体外模拟体内生理环境,在无菌、适当温度和一定营养条件下.使从体内取出的组织生存、生长繁殖和传代,并维持原有的结构和功能特性.广义的组织培养与体外培养同义.体外培养(Invitro)包括所有结构层次的培养,即：组织培养、细胞培养和器官培养.
所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长.
组织培养的发展史已有近百年,最初的组织培养是胚胎学和微生物学的引申,建立于无菌原则上,用天然体液（如胎汁、血浆）来维持从整体切下的组织块,对细胞进行形态和功能的观察.
通过许多学者大的改进和革新,培养基由天然动物血浆改为合成培养基,促进细胞生长物质从胎汁改为动物血清.现在全世界贮存的细胞约有万种以上.组织培养不仅是细胞生物学必需的技术,也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法.
二．基本原理和方法
体外培养细胞的生存条件：
(一)营养.
体外培养细胞所需的营养物质与体内相同,主要有糖、氨基酸和维生素三大类.目前市面上销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够,但在使用合成培养基时,仍需加入一些天然成份,如人或动物的血清、血浆和胎汁等.目前主要使用血清,以牛血清为主.血清的生物效应早已证明,它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等.不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁.不同血清对细胞作用不同.以小牛血清最好,成年牛和马血清次之.合成培养基中不加血清也能维持细胞生存,但不能很好生长,加入5%的血清,对大多数细胞来说,能维持细胞不死和缓慢生长,要使细胞正常生长,一般需加10～15%的小牛血清.每个批号血清使用前要加热处理,一般灭活于56℃水浴中30分钟,每个批号血清使用前要加热处理,一般灭活于56℃水浴中30分钟,每5分钟摇一次.10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液,2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液.添加血清,虽利于细胞生长,但增加了不明成分,给分析实验结果带来了困难.因此,人们正在探索不用血清的无血清液并已取得了一定进展.
（二）环境
1．无菌：无菌是保证培养细胞生存的首要条件.培养液不仅对细胞是高营养物,对细菌和霉菌也是高度营养物,细胞培养中如污染微生物,其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡,因此细胞培养技术的关键之一是防止污染.污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身.因此,培养室的空气等要彻底消毒,所有操作均要严格实行无菌操作,各种物品拿入操作台前应消毒,用洒精擦表面,用前于紫外线照；操作者洗手、泡手,酒精擦手,打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定,操作时须将瓶、管斜放,吸管注入液体应避免和瓶口接触,操作时禁止讲话.
2.温度：组织培养的最适温度为35-37℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢和生长将会受到影响,甚至导致死亡.培养细胞对低温的耐受力比高温强.温度增加2-3℃对细胞产生不良影响,使之在24小时死亡,温度在43℃以上,细胞大多被杀灭,而低温对细胞影响较小,细胞置于25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度缓慢,放在4℃数小时之后,再置37℃培养,细胞仍能继续生长.
3.气体：气体也是细胞生存的必需条件之一.所需的气体主要有O2和CO2.O2参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分.CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需成分.它主要与维持培养液pH值有直接关系.
4.pH值：多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4,偏离此范围对细胞可产生有害的影响.各种细胞对pH值的要求也不完全相同,但总的来说,细胞耐酸性比耐碱性大一些.培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐/ CO2.细胞代谢产生的各种酸使pH下降,而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH增加.
5.培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大,除少数悬浮生长的细胞外,绝大多数细胞属于贴壁依赖性细胞或培养物.它们只有贴附于不起化学作用的物体的表面时,才能生长、生存或维持功能.目前,常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类.玻璃器皿一般须用清洁液浸泡1至7天,清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次,烤干备用.用前160℃高温消毒2小时后使用.96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小时后,清水洗净再用1N HCL浸泡4小时,用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗,37℃干燥后,紫外线灯照射消毒；新橡皮塞须先用1/2NnaOH煮沸15分钟,冲洗后再用4%HCL煮沸15分钟,清水冲洗后用蒸馏水洗5次,煮沸10分钟灭菌,或送高压灭菌.
总之,细胞在适当的培养条件下可迅速增殖,但若遇到不良环境细胞会变圆,停止生长,甚至死亡,这是细胞的保护机制.综上所述,细胞培养的基本条件主要包括了营养液、无菌条件、PH、温度、气体条件和培养器皿的清洁度.
三．常用的培养方法
根据培养物细胞生物学的特点,组织培养可分为原代培养和传代培养.亦可根据培养条件和器皿的不同而分为静置培养和动态培养.静置培养为最常见的方式,细胞可为贴壁型细胞,亦可为悬浮的不贴壁细胞.
（一） 传代细胞的静置培养
我室现存的细胞均为传代细胞,CNE-2Z是我们80年代从一鼻咽癌病人取组织经过体外原代培养、传代培养、连续传代,生长稳定,并经过一系列的生长特性检测（如生长曲线、分裂指数、细胞群体倍增时间、集落形成率）、染色体分析、异体移植、电镜观察等而建立的,并于83年荣获省高教厅及卫生厅科研成果一等奖,84年卫生部科研成果乙等奖.建系20年来,CNE-2Z已在全世界广泛应用,我室也仍有保存和应用.
培养细胞的观察和传代:所有体外培养细胞,包括原代培养和各种细胞系（株）,当生长达到一定的密度后,都需要做传代处理.传代的频率和间隔与接种细胞的数量、细胞生物学特性以及营养性质等有关.接种细胞多则细胞数饱和速度快；肿瘤细胞系比原代培养细胞增殖快,培养液中血清含量多时,细胞增殖快.一般是在细胞长满瓶壁、营养及PH稍降低时做传代培养,依据细胞特性,将一瓶细胞1：3或1：4传代.在细胞长满时,应尽早传代,否则细胞会中毒,形态发生改变,重则从壁上脱落死亡.传代过晚（若已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态,细胞需要再传一两代,把不健康的细胞除去,才能恢复使用.那么,怎样才能做到及时传代呢?要做到及时传代,每天要仔细观察细胞的生长情况来决定是否要换液或传代.一般是形态观察,用倒置显微镜对活细胞形态、胞浆和胞膜进行观察.生长状态良好的细胞透明度大,细胞内颗粒少,看不见空泡,胞膜清晰,折光性强.培养上清液清晰透明,看不见悬浮的细胞和碎片.细胞机能不良时,胞质中常出现空泡,脂滴和其它颗粒状物,细胞之间空隙加大,细胞形态可变得不规则,甚至失去原有的特点.只有状态良好的细胞才能用来做实验.一般在细胞接种或传代后,每天或至多间隔1-2天,应观察细胞形态、细胞生长、培养液PH值和污染与否等,随时掌握细胞动态变化,以便于做换液或传代处理.如发现异常情况,及时采取措施.正常情况下,培养液呈桃红色,用一般温箱培养时,随细胞生长时间的延长,二氧化碳积累增多,由于培养基内有PH指示剂的存在,其颜色可间接反映细胞的生长状态.呈橙黄色时,细胞一般生长状态较好；呈淡黄色则可能是培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多；呈紫红色则可能是细胞生长状态不好或已死亡.
（二） 培养细胞的保存和复苏
做实验前要先学会冻存,以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞,且可减少污染或其它不利影响.
1.影响冻存细胞活性的因素
（1）细胞冻存保护剂：常用的有二甲基亚砜（DMSO）和甘油,常用的浓度为5%-10%（90%小牛血清）.DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小.
（2）细胞悬液的冻结速度：慢冻时冰冻在细胞外形成,因此不致损害细胞.多数细胞以每分钟下降1℃的速度,降至-20℃冻结.均可获得满意效果.
（3）保存温度：液氮罐,可达到-196℃,此时所有的物理化学活动均降至最低限度,以保证细胞长期保存.
（4）复苏：急速融化复苏可防止损害细胞.冻结细胞从液氮中取出后,应立即放入37℃～43℃的水浴中,30秒至一分钟内融化.
2.冻存与复苏方法
适用于原始组织、原代细胞和细胞系（株）.A.细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2～5X106/ml.B.分装于2ml冻存管中,装量1ml,封口,作好标记,用几层纱布扎好.C.冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程,以1℃/min的速度降温,一般挂在液氮上空8小时后,投入液氮贮存罐中长期保存.D.为使冻存的细胞复苏,将冻存管置于37℃～43℃水浴中,充分摇动使其急速融化,30秒至1分钟内完成.E.细胞悬液低速离心,去除上清中的保护添加剂,加入原来使用的生长液,置37℃培养.
四．基本设备和试剂
设备（略）,环境要求清洁、空气干燥和无烟尘.
基本试剂
培养液：①1640溶于新蒸的三次蒸馏水中,搅拌使其充分溶解,过滤除菌即可.②小牛血清用前56℃X30分钟灭活（破坏补体）分装置-20℃保存备用.③青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2次后的三蒸水100ml充分溶解,分装冻存于-20℃,使用前融化,每100ml生长液中加1ml,即使用终浓度为含P.S 100μg/ml.（注：P.S不能冻融多次,应少量分装,一次用完）.④NaHCO3液,用于调整pH值,常用浓度为5～6%,配制用三蒸水溶解后过滤除菌或高压灭菌,分装4℃保存.⑤胰蛋白酶 在pH 8.0,温度37℃时作用力最强（详见配方）.⑥EDTA液（详见配方）.
附：
胰酶消化液配方（500ml）
NaCL 4 g
KCL（19%） 1 ml
Na2HPO4 0.126g(12H2O)
Tris 1.5g(三羟甲基氨基甲烷)
以上药物充分溶解后加水至500 ml,然后再加胰蛋白酶5g,最后用1N HCL调pH至7.7,过滤除菌分装,然后-20℃保存备用.
EDTA液配方（0.2% 1000ml）
EDTA(versene) 2 g
NaCL 8 g
KCL 0.2g
Na2HPO4(12H2O) 2.9g
KH2PO4 0.2g
以上药物同样充分溶解后,加新鲜的三蒸水至1000 ml,分装然后高压15磅30分钟灭菌,最后4℃保存备用.
细胞冻存液：小牛血清90℅与二甲基亚砜（DMSO）10℅混合; -20℃冰箱保存备用.或小牛血清30℅,1640培养液60℅,DMSO10℅混合; - 20℃冰箱保存备用.
所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长.
组织培养的发展史已有近百年,最初的组织培养是胚胎学和微生物学的引申,建立于无菌原则上,用天然体液（如胎汁、血浆）来维持从整体切下的组织块,对细胞进行形态和功能的观察.
通过许多学者大的改进和革新,培养基由天然动物血浆改为合成培养基,促进细胞生长物质从胎汁改为动物血清.现在全世界贮存的细胞约有万种以上.组织培养不仅是细胞生物学必需的技术,也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法.
二．基本原理和方法
体外培养细胞的生存条件：
(一)营养.
体外培养细胞所需的营养物质与体内相同,主要有糖、氨基酸和维生素三大类.目前市面上销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够,但在使用合成培养基时,仍需加入一些天然成份,如人或动物的血清、血浆和胎汁等.目前主要使用血清,以牛血清为主.血清的生物效应早已证明,它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等.不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁.不同血清对细胞作用不同.以小牛血清最好,成年牛和马血清次之.合成培养基中不加血清也能维持细胞生存,但不能很好生长,加入5%的血清,对大多数细胞来说,能维持细胞不死和缓慢生长,要使细胞正常生长,一般需加10～15%的小牛血清.每个批号血清使用前要加热处理,一般灭活于56℃水浴中30分钟,每个批号血清使用前要加热处理,一般灭活于56℃水浴中30分钟,每5分钟摇一次.10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液,2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液.添加血清,虽利于细胞生长,但增加了不明成分,给分析实验结果带来了困难.因此,人们正在探索不用血清的无血清液并已取得了一定进展.
（二）环境
1．无菌：无菌是保证培养细胞生存的首要条件.培养液不仅对细胞是高营养物,对细菌和霉菌也是高度营养物,细胞培养中如污染微生物,其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡,因此细胞培养技术的关键之一是防止污染.污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身.因此,培养室的空气等要彻底消毒,所有操作均要严格实行无菌操作,各种物品拿入操作台前应消毒,用洒精擦表面,用前于紫外线照；操作者洗手、泡手,酒精擦手,打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定,操作时须将瓶、管斜放,吸管注入液体应避免和瓶口接触,操作时禁止讲话.
2.温度：组织培养的最适温度为35-37℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢和生长将会受到影响,甚至导致死亡.培养细胞对低温的耐受力比高温强.温度增加2-3℃对细胞产生不良影响,使之在24小时死亡,温度在43℃以上,细胞大多被杀灭,而低温对细胞影响较小,细胞置于25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度缓慢,放在4℃数小时之后,再置37℃培养,细胞仍能继续生长.
3.气体：气体也是细胞生存的必需条件之一.所需的气体主要有O2和CO2.O2参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分.CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需成分.它主要与维持培养液pH值有直接关系.
4.pH值：多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4,偏离此范围对细胞可产生有害的影响.各种细胞对pH值的要求也不完全相同,但总的来说,细胞耐酸性比耐碱性大一些.培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐/ CO2.细胞代谢产生的各种酸使pH下降,而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH增加.
5.培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大,除少数悬浮生长的细胞外,绝大多数细胞属于贴壁依赖性细胞或培养物.它们只有贴附于不起化学作用的物体的表面时,才能生长、生存或维持功能.目前,常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类.玻璃器皿一般须用清洁液浸泡1至7天,清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次,烤干备用.用前160℃高温消毒2小时后使用.96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小时后,清水洗净再用1N HCL浸泡4小时,用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗,37℃干燥后,紫外线灯照射消毒；新橡皮塞须先用1/2NnaOH煮沸15分钟,冲洗后再用4%HCL煮沸15分钟,清水冲洗后用蒸馏水洗5次,煮沸10分钟灭菌,或送高压灭菌.
总之,细胞在适当的培养条件下可迅速增殖,但若遇到不良环境细胞会变圆,停止生长,甚至死亡,这是细胞的保护机制.综上所述,细胞培养的基本条件主要包括了营养液、无菌条件、PH、温度、气体条件和培养器皿的清洁度.
三．常用的培养方法
根据培养物细胞生物学的特点,组织培养可分为原代培养和传代培养.亦可根据培养条件和器皿的不同而分为静置培养和动态培养.静置培养为最常见的方式,细胞可为贴壁型细胞,亦可为悬浮的不贴壁细胞.
（一） 传代细胞的静置培养
我室现存的细胞均为传代细胞,CNE-2Z是我们80年代从一鼻咽癌病人取组织经过体外原代培养、传代培养、连续传代,生长稳定,并经过一系列的生长特性检测（如生长曲线、分裂指数、细胞群体倍增时间、集落形成率）、染色体分析、异体移植、电镜观察等而建立的,并于83年荣获省高教厅及卫生厅科研成果一等奖,84年卫生部科研成果乙等奖.建系20年来,CNE-2Z已在全世界广泛应用,我室也仍有保存和应用.
培养细胞的观察和传代:所有体外培养细胞,包括原代培养和各种细胞系（株）,当生长达到一定的密度后,都需要做传代处理.传代的频率和间隔与接种细胞的数量、细胞生物学特性以及营养性质等有关.接种细胞多则细胞数饱和速度快；肿瘤细胞系比原代培养细胞增殖快,培养液中血清含量多时,细胞增殖快.一般是在细胞长满瓶壁、营养及PH稍降低时做传代培养,依据细胞特性,将一瓶细胞1：3或1：4传代.在细胞长满时,应尽早传代,否则细胞会中毒,形态发生改变,重则从壁上脱落死亡.传代过晚（若已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态,细胞需要再传一两代,把不健康的细胞除去,才能恢复使用.那么,怎样才能做到及时传代呢?要做到及时传代,每天要仔细观察细胞的生长情况来决定是否要换液或传代.一般是形态观察,用倒置显微镜对活细胞形态、胞浆和胞膜进行观察.生长状态良好的细胞透明度大,细胞内颗粒少,看不见空泡,胞膜清晰,折光性强.培养上清液清晰透明,看不见悬浮的细胞和碎片.细胞机能不良时,胞质中常出现空泡,脂滴和其它颗粒状物,细胞之间空隙加大,细胞形态可变得不规则,甚至失去原有的特点.只有状态良好的细胞才能用来做实验.一般在细胞接种或传代后,每天或至多间隔1-2天,应观察细胞形态、细胞生长、培养液PH值和污染与否等,随时掌握细胞动态变化,以便于做换液或传代处理.如发现异常情况,及时采取措施.正常情况下,培养液呈桃红色,用一般温箱培养时,随细胞生长时间的延长,二氧化碳积累增多,由于培养基内有PH指示剂的存在,其颜色可间接反映细胞的生长状态.呈橙黄色时,细胞一般生长状态较好；呈淡黄色则可能是培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多；呈紫红色则可能是细胞生长状态不好或已死亡.
（二） 培养细胞的保存和复苏
做实验前要先学会冻存,以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞,且可减少污染或其它不利影响.
1.影响冻存细胞活性的因素
（1）细胞冻存保护剂：常用的有二甲基亚砜（DMSO）和甘油,常用的浓度为5%-10%（90%小牛血清）.DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小.
（2）细胞悬液的冻结速度：慢冻时冰冻在细胞外形成,因此不致损害细胞.多数细胞以每分钟下降1℃的速度,降至-20℃冻结.均可获得满意效果.
（3）保存温度：液氮罐,可达到-196℃,此时所有的物理化学活动均降至最低限度,以保证细胞长期保存.
（4）复苏：急速融化复苏可防止损害细胞.冻结细胞从液氮中取出后,应立即放入37℃～43℃的水浴中,30秒至一分钟内融化.
2.冻存与复苏方法
适用于原始组织、原代细胞和细胞系（株）.A.细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2～5X106/ml.B.分装于2ml冻存管中,装量1ml,封口,作好标记,用几层纱布扎好.C.冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程,以1℃/min的速度降温,一般挂在液氮上空8小时后,投入液氮贮存罐中长期保存.D.为使冻存的细胞复苏,将冻存管置于37℃～43℃水浴中,充分摇动使其急速融化,30秒至1分钟内完成.E.细胞悬液低速离心,去除上清中的保护添加剂,加入原来使用的生长液,置37℃培养.
四．基本设备和试剂
设备（略）,环境要求清洁、空气干燥和无烟尘.
基本试剂
培养液：①1640溶于新蒸的三次蒸馏水中,搅拌使其充分溶解,过滤除菌即可.②小牛血清用前56℃X30分钟灭活（破坏补体）分装置-20℃保存备用.③青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2次后的三蒸水100ml充分溶解,分装冻存于-20℃,使用前融化,每100ml生长液中加1ml,即使用终浓度为含P.S 100μg/ml.（注：P.S不能冻融多次,应少量分装,一次用完）.④NaHCO3液,用于调整pH值,常用浓度为5～6%,配制用三蒸水溶解后过滤除菌或高压灭菌,分装4℃保存.⑤胰蛋白酶 在pH 8.0,温度37℃时作用力最强（详见配方）.⑥EDTA液（详见配方）.
附：
胰酶消化液配方（500ml）
NaCL 4 g
KCL（19%） 1 ml
Na2HPO4 0.126g(12H2O)
Tris 1.5g(三羟甲基氨基甲烷)
以上药物充分溶解后加水至500 ml,然后再加胰蛋白酶5g,最后用1N HCL调pH至7.7,过滤除菌分装,然后-20℃保存备用.
EDTA液配方（0.2% 1000ml）
EDTA(versene) 2 g
NaCL 8 g
KCL 0.2g
Na2HPO4(12H2O) 2.9g
KH2PO4 0.2g
以上药物同样充分溶解后,加新鲜的三蒸水至1000 ml,分装然后高压15磅30分钟灭菌,最后4℃保存备用.
细胞冻存液：小牛血清90℅与二甲基亚砜（DMSO）10℅混合; -20℃冰箱保存备用.或小牛血清30℅,1640培养液60℅,DMSO10℅混合; - 20℃冰箱保存备用.