蛋白质层析、超滤常用技术手段

蛋白质层析、超滤常用技术手段

在分离分析特别是蛋白质分离分析中,层析是相当重要、且相当常见的一种技术,其原理较为复杂,对人员的要求相对较高,这里只能做一个相对简单的介绍.
一、 吸附层析
1、 吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法.
2、 薄层层析
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相,以液体为流动相的一种层析方法.这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层,然后按纸层析操作进行展层.
3、 聚酰胺薄膜层析
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键.这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小.层析时,展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键.因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程,就能导致分离物质达到分离目的.
二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的.离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的.离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行.`
三、 凝胶过滤
凝胶过滤又叫分子筛层析,其原因是凝胶具有网状结构,小分子物质能进入其内部,而大分子物质却被排除在外部.当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量筛分开了.
四、 亲和层析
亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似,每对反应物之间都有一定的亲和力.正如在酶与底物的反应中,特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合,产生复合物(E－S')一样.在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力,并产生复合物.而亲和层析与酶一底物反应不同的是,前者进行反应时,配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时,底物呈液相存在.实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上,制成亲和吸附剂M－L,或者叫做固相载体.而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力.因此,当把围相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后,让欲分离的样品液通过该柱.这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力,以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上,而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来,并形成了第一个层析峰.然后,恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子,即可把物质S从固相载体上解离下来,并形成了第M个层析峰(见图6－2).显然,通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开.如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时,采用选择性缓冲液进行洗脱,也可以将它们分离开.用过的固相载体经再生处理后,可以重复使用.
上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法.除此之外,还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法.这两种亲和层析法相比,前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等),它具有较强的吸附选择性和较大的结合力.而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料,以及氨基酸等),它成本低廉、具有较高的吸附容量,通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率.
五、 聚焦层析
聚焦层析也是一种柱层析.因此,它和另外的层析一样,照例具有流动相,其流动相为　多缓冲剂,固定相为多缓冲交换剂.
聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述.
1、PH梯度溶液的形成
在离子交换层析中,PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的.例如,当使用阴离子 剂进行层析时,制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是,在梯度仪的混合室(这层析柱者)中装高PH溶液,而在另一室装低PH极限溶液,然后打开层析柱的下端出口,让洗脱液连续不断地流过柱体.这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的.而在聚焦层析中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团,故PH梯度溶液可以自动形成.例如,当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时,先用起始缓冲液(配方见表了一2)平衡到PHg,再用含PH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体,这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用.随着淋洗液的不断加人,住内每点的PH值从高到低逐渐下降.照此处理J段时间,从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度.聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的,但是随着淋洗的进行,PH梯度会逐渐向下迁移,从底部流出液的PH却由9逐渐降至6,并最后恒定于此值,这时层析柱的PH梯度也就消失了.
2．蛋白质的行为
蛋白质所带电荷取决于它的等电点(PI)和层析柱中的PH值.当柱中的PH低于蛋白质的PI时,蛋白质带正电荷,且不与阴离于交换剂结合.而随着洗脱剂向前移动,固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的.当蛋白质移动至环境PH高于其PI时,蛋白质由带正电行变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合.由于洗脱剂的通过,蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时,它又带正电荷,并从交换剂解吸下来.随着洗脱液向柱底的迁移,上述过程将反复进行,于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来,从而达到了分离的目的.
不同蛋白质具有不同的等电点,它们在被离子交换剂结合以前,移动之距离是不同的,洗脱出来的先后次序是按等电点排列的.

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　随着现代生物技术的发展, 通过基因工程生产蛋白质药物在治疗人类面临的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潜力. 为满足生物技术产品工业化生产的需要, 开发高通量、低成本、高效的分离纯化方法已引起人们的高度关注. 超滤技术由于具有通量高, 操作条件温和, 易于放大等特点, 特别适合生物活性大分子的分离. 在生物技术领域, 超滤技术目前已广泛应用于细胞收集分离、除菌消毒、缓冲液置换、分级( fract ionatio n) 、脱盐及浓缩[ 1] . 近年来越来越多的研究表明, 通过选择适当的膜或膜表面改性,以及对分离过程进行优化, 充分利用和调控膜—蛋白质以及蛋白质—蛋白质之间的静电相互作用, 可以实现分子量相近的两种蛋白质的高选择性超滤分离[2- 7] .

　　为克服常规蛋白质超滤分离过程优化中存在的实验蛋白质消耗多、工作量大、费时以及费用高等缺点, 我们相继开发了脉冲进样技术( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和参数连续变化超滤技术( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 并以此为基础, 结合载体相超滤技术( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]进一步提出了一种蛋白质超滤分离快速优化新方法[11], 实现了人血浆白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化单克隆抗体( A lemtuzumab) 单体— 二聚体[13]的超滤分离过程快速优化和高选择性分离,并在膜的筛选及其适用性快速评估方面展现出巨大的潜力. 该方法的主要特征是与AKTA Prime 系统联用, 采用脉动进样技术显著减少了蛋白质的用量;而利用双缓冲体系( 类似梯度洗脱) 的参数连续变化超滤技术, 在pH 或离子强度连续变化的情况下考查pH 或离子强度对蛋白质透过率或截留率的影响, 进一步缩短了实验时间, 降低了蛋白质的用量,极大地减少了实验量, 加快了过程优化进程; 另外,载体相超滤技术的应用则可保证超滤分离自始至终在设定的条件下进行, 从而最大限度地保证超滤过程的稳定性.