很大的质粒如何酶切连接,如载体13k,片段3k

平末端连接问题最近在做载体构建,有一个5k左右的片段要连接到一个12k左右的载体骨架上,两端都是平末端,始终连不上,不知 为什么我的目的基因连接克隆载体转化、提质粒后,酶切鉴定正确,而质粒PCR和菌液PCR鉴定都不正确呢?着急 为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接,酶切的图示 质粒和目的基因片段分别双酶切（bamh1,xba1）连接后电转感受态细胞,同时将质粒酶切回收的片段转化做对照 目的基因片段与载体质粒的选择? 用同种限制酶切质粒和含有目的基因的DNA,用DNA连接酶连接后为什么不会出现载体-目的基因连接物这种产物? 如何验证载体质粒的酶切位点已被切开?PCR产物（目的基因）被酶切开? 用同种限制酶切质粒和目的基因DNA,连接后,产生的载体-载体连接物不是也有标记基因而且在培养基上生长吗 如何使目的基因连接到质粒载体上,目的基因怎么获得呢? 目的片段转入表达载体后我用什么方法可以检测我的目的质粒? 您好,将目的片段连接T载体后为什么要作感受态?目的是什么?T载体就是质粒吗,属性是什么? 目的基因片段与载体DNA连接的主要有?