大师作文网亲和层析的操作步骤?
来源：学生作业帮 编辑：大师作文网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/11/11 09:43:29
亲和层析的操作步骤?
实验方法
1．琼脂糖活化
⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干,加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤,立即转入100ml烧杯中,冰浴置于磁力搅拌器上.
⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰,加水20ml溶解,然后倒入琼脂糖中,小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右,反应10min.在1min~2min迅速调整pH为8.11.0维持10min.
⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中,以冰水抽洗成中性,再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗.
2．偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体.
⑴ 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体).
⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内,从抽洗到偶联）,4℃缓慢搅拌过夜,使蛋白与活化的琼脂结合.
3．装柱
⑴ 选柱：不宜过大,一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml.
⑵ 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内,拧紧下口夹,让其下沉,数分钟后松开下口夹,使溶液约以1ml/min的速度流出.
⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止.
收集全部的洗脱液,测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量,由此可计算偶联率.
4．吸附与解吸附
⑴按床体积1/10加样,浓度为1％～2%,缓慢加入待纯化的抗体（或抗原）,用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱,流速为1ml/min,至洗出液OD280＜0.02为止.
⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液,流速1ml/min,收集解吸附下来的成分,立即以1Mol/L NaHCO3中和,以免蛋白变性.
5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤,再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤,平衡后,可继续使用.保存可加入0.02%Na N3于4℃保存.防止冷冻和干裂.
6．结果判定
⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定.
⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并,以生理盐水透析,然后浓缩或冻干保存.
1．琼脂糖活化
⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干,加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤,立即转入100ml烧杯中,冰浴置于磁力搅拌器上.
⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰,加水20ml溶解,然后倒入琼脂糖中,小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右,反应10min.在1min~2min迅速调整pH为8.11.0维持10min.
⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中,以冰水抽洗成中性,再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗.
2．偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体.
⑴ 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体).
⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内,从抽洗到偶联）,4℃缓慢搅拌过夜,使蛋白与活化的琼脂结合.
3．装柱
⑴ 选柱：不宜过大,一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml.
⑵ 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内,拧紧下口夹,让其下沉,数分钟后松开下口夹,使溶液约以1ml/min的速度流出.
⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止.
收集全部的洗脱液,测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量,由此可计算偶联率.
4．吸附与解吸附
⑴按床体积1/10加样,浓度为1％～2%,缓慢加入待纯化的抗体（或抗原）,用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱,流速为1ml/min,至洗出液OD280＜0.02为止.
⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液,流速1ml/min,收集解吸附下来的成分,立即以1Mol/L NaHCO3中和,以免蛋白变性.
5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤,再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤,平衡后,可继续使用.保存可加入0.02%Na N3于4℃保存.防止冷冻和干裂.
6．结果判定
⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定.
⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并,以生理盐水透析,然后浓缩或冻干保存.