大师作文网TA克隆出现假阳性的原因有哪些?
来源：学生作业帮 编辑：大师作文网作业帮 分类：综合作业 时间：2024/11/12 10:04:04
TA克隆出现假阳性的原因有哪些?
不知对不对.
第一,TA克隆的自身环化是造成这种现象的最主要原因,根据我的经验,不同公司提供的TA载体的自身环化率在20%到50%之间.这个比例可以通过优化连接反应的条件进行改善.无非就是提高反应体系中目的基因片段的含量,通常DNA:TA载体大概应在1：3左右,加入更多片段可以显著提高链接的效率.再就是提高DNA片段的纯度,减少其中的杂质,这需要通过改进DNA凝胶纯化的方法来实现.QIAGEN的凝胶纯化试剂盒非常好.常量高纯度也好.
第二,除了自身环化之外就是在PCR产物不纯,里面还有引物等小片段,这些东西更容易与TA载体链接,最后进行酶切鉴定时又看不到插入片段.这一般不容易发生,有的人喜欢用柱子纯化PCR产物,我则习惯跑胶后纯化,这样PCR产物和引物等已经完全分离,则不会发生这种情况.
第一点是最主要的,改善链接反应后可以将假阳性的比例降至极低,前段时间我克隆了10个基因,每板挑取4个克隆,其中8个基因的片段插入率都能达到100%.另2两也能达到75%.选用高质量的TA和凝胶纯化试剂盒是关键.推荐QIAGEN的凝胶纯化和PROMEGA的TA克隆.
第一,TA克隆的自身环化是造成这种现象的最主要原因,根据我的经验,不同公司提供的TA载体的自身环化率在20%到50%之间.这个比例可以通过优化连接反应的条件进行改善.无非就是提高反应体系中目的基因片段的含量,通常DNA:TA载体大概应在1：3左右,加入更多片段可以显著提高链接的效率.再就是提高DNA片段的纯度,减少其中的杂质,这需要通过改进DNA凝胶纯化的方法来实现.QIAGEN的凝胶纯化试剂盒非常好.常量高纯度也好.
第二,除了自身环化之外就是在PCR产物不纯,里面还有引物等小片段,这些东西更容易与TA载体链接,最后进行酶切鉴定时又看不到插入片段.这一般不容易发生,有的人喜欢用柱子纯化PCR产物,我则习惯跑胶后纯化,这样PCR产物和引物等已经完全分离,则不会发生这种情况.
第一点是最主要的,改善链接反应后可以将假阳性的比例降至极低,前段时间我克隆了10个基因,每板挑取4个克隆,其中8个基因的片段插入率都能达到100%.另2两也能达到75%.选用高质量的TA和凝胶纯化试剂盒是关键.推荐QIAGEN的凝胶纯化和PROMEGA的TA克隆.