过氧化氢酶活性的测定

来源：学生作业帮编辑：大师作文网作业帮分类：生物作业时间：2024/11/12 15:25:14

过氧化氢酶活性的测定

过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低.根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性.
【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
【试剂】
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）.
【方法】
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度.混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液.5℃下保存备用.
2.测定：取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表40-2顺序加入试剂.
表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管号
S1
S2
S3

粗酶液(ml)
0.2
0.2
0.2

pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5

蒸馏水(ml)
1.0
1.0
1.0

25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性.
3.结果计算：
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）.
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）.

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