大师作文网【跪求】我的PCR体系应该怎么设定?退火温度?
来源：学生作业帮 编辑：大师作文网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/11/13 21:00:34
【跪求】我的PCR体系应该怎么设定?退火温度?
我做一种真菌的pcr,引物序列左：aatcgacccgtttccgcctt,
右：gttagattgaccgcgattcc,生工合成单给的退火温度分别是59.85和57.8
我的25微升体系：10*buffer（含镁） 2.5
dntps 0.5
引物分别 0.5
DNA模板 1
rTaq 1U
1%琼脂糖电泳,结果DL2000和二聚体都很亮,就是没有特异性条带,请问各位大侠,我那里出了问题,退火温度,我降低5度还是没有,请问引物多和模板多,是否影响结果,镁离子是否要单加,朋友给我找找原因,我摸索2月没有结果了!
我做一种真菌的pcr,引物序列左：aatcgacccgtttccgcctt,
右：gttagattgaccgcgattcc,生工合成单给的退火温度分别是59.85和57.8
我的25微升体系：10*buffer（含镁） 2.5
dntps 0.5
引物分别 0.5
DNA模板 1
rTaq 1U
1%琼脂糖电泳,结果DL2000和二聚体都很亮,就是没有特异性条带,请问各位大侠,我那里出了问题,退火温度,我降低5度还是没有,请问引物多和模板多,是否影响结果,镁离子是否要单加,朋友给我找找原因,我摸索2月没有结果了!
根据你描述,体系可能性不大.所以给如下建议：
1.检查引物,确保正反向设计没有问题,而且最后都是从5到3顺序书写并送交合成（这种错误很低级,但有人犯过,所以提醒,如果自己不很保证就让别人把把关）.
2.再次要求生工合成引物（合错可能性有,不大）,或者重新换位置设计引物
2.由于是真菌,你用基因组还是cdna做模板?倘若后者要考虑你cdna质量是否够好.前者,那么可能内含子太多你pcr延伸时间不够?
3.尝试温度梯度pcr
4.尝试热启动pcr（特殊热启动酶,或者待遇变形快要结束时再加入taq）
5.可以考虑用不含有mg的buffer,然后可以做mg梯度pc
1.检查引物,确保正反向设计没有问题,而且最后都是从5到3顺序书写并送交合成（这种错误很低级,但有人犯过,所以提醒,如果自己不很保证就让别人把把关）.
2.再次要求生工合成引物（合错可能性有,不大）,或者重新换位置设计引物
2.由于是真菌,你用基因组还是cdna做模板?倘若后者要考虑你cdna质量是否够好.前者,那么可能内含子太多你pcr延伸时间不够?
3.尝试温度梯度pcr
4.尝试热启动pcr（特殊热启动酶,或者待遇变形快要结束时再加入taq）
5.可以考虑用不含有mg的buffer,然后可以做mg梯度pc