连接反应产物,是否可以直接做PCR模板?要不要先灭活其中的T4连接酶?
来源:学生作业帮 编辑:大师作文网作业帮 分类:综合作业 时间:2024/10/08 04:32:28
连接反应产物,是否可以直接做PCR模板?要不要先灭活其中的T4连接酶?
我手头上有六段DNA片段(假定分别为A,B,C,D,E,F),每个片段大约30-40bp左右.每个片段两端均为粘末端,其中A与B,B与C,C与D,D与E,E与F的粘末端可以互补匹配,并且是唯一的匹配(举例:A的粘末端仅与B的匹配,而不能与C,D,E,F的匹配,等等).我的想法是用T4连接酶一次性把这6段DNA片段连接成约200bp左右的长片段,然后在长片段两端设计两个PCR引物进行扩增.然后将PCR片段割胶回收,然后双酶切,最后连接到经过了同样双酶切的质粒中.请问这样的思路是否可行,其中有什么地方要注意?还有就是上面的连接反应产物是否可以直接用来做PCR?,要不要先灭活其中的T4连接酶?
我手头上有六段DNA片段(假定分别为A,B,C,D,E,F),每个片段大约30-40bp左右.每个片段两端均为粘末端,其中A与B,B与C,C与D,D与E,E与F的粘末端可以互补匹配,并且是唯一的匹配(举例:A的粘末端仅与B的匹配,而不能与C,D,E,F的匹配,等等).我的想法是用T4连接酶一次性把这6段DNA片段连接成约200bp左右的长片段,然后在长片段两端设计两个PCR引物进行扩增.然后将PCR片段割胶回收,然后双酶切,最后连接到经过了同样双酶切的质粒中.请问这样的思路是否可行,其中有什么地方要注意?还有就是上面的连接反应产物是否可以直接用来做PCR?,要不要先灭活其中的T4连接酶?
这样做实际上是不可行的,效率会很低.我以前也想你一样试过.
原因:粘性末端相连的机会不大,而且要6个同时都相连,机会是呈指数级别下降的.而且如果直接做PCR的话,那些没有连接或者部分连接的片段十个极大的干扰.
2个方案:既然酶切位点独特,建议把A和F修改为直接可以和质粒互补的末端,连接后直接克隆.比做PCR的可能性要大.
或者先做AB, CD, EF连接,克隆后再做两次ABCD+EF连接.
原因:粘性末端相连的机会不大,而且要6个同时都相连,机会是呈指数级别下降的.而且如果直接做PCR的话,那些没有连接或者部分连接的片段十个极大的干扰.
2个方案:既然酶切位点独特,建议把A和F修改为直接可以和质粒互补的末端,连接后直接克隆.比做PCR的可能性要大.
或者先做AB, CD, EF连接,克隆后再做两次ABCD+EF连接.
pcr产物不纯化直接酶切连接可以吗?PCR反应的buffer会不会对酶产生影响哦~
T4连接酶可以连接平末端,一样可以连接粘性末端,好像比DNA连接酶厉害的感觉,为什么通常都用DNA连接酶?
T4噬菌体DNA连接酶连接DNA的特点
PCR产物可以直接测序吗
基因克隆实验克隆实验问题 1、以cDNA为模板做PCR反应,得到的产物和预期的长度一样.2、再用pMD-19载体连接目的
如果PCR产物可以直接用来测序,但为什么还需要买PCR产物纯化试剂盒,还要进行连接转化提质粒酶切?
PCR产物直接测序的原理
real-time PCR可以直接以细菌的DNA为模板进行定量分析吗?还是real-time PCR 是针对RNA的啊?
大肠杆菌可以直接做PCR吗
郑州哪里可以做微生物菌种鉴定的DNA或PCR产物测序啊?
请问PCR产物双酶切后跑电泳结果是怎样的,对PCR产物做这个有意义吗
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