western blot!拜托各位大侠看看我跑出这个条带到底是什么问题啊.
来源:学生作业帮 编辑:大师作文网作业帮 分类:生物作业 时间:2024/09/20 11:44:04
western blot!拜托各位大侠看看我跑出这个条带到底是什么问题啊.
我先说下我的条件:
跑的蛋白44KD,胶的浓度分别是5%和12%.
转膜:湿转 1.5h,0.25A
封闭:5%脱脂牛奶2h ,室温
一抗:1:500 4°过夜
二抗:1:10000 37° 1h
曝光完以后,有很高的背景,并且条带不清晰.但是之前做出来过.不知问题出在哪?
我先说下我的条件:
跑的蛋白44KD,胶的浓度分别是5%和12%.
转膜:湿转 1.5h,0.25A
封闭:5%脱脂牛奶2h ,室温
一抗:1:500 4°过夜
二抗:1:10000 37° 1h
曝光完以后,有很高的背景,并且条带不清晰.但是之前做出来过.不知问题出在哪?
转膜电流太大了,有可能是转过了,建议你用丽春红染下膜,看看蛋白条带是否清晰.我一般用恒压75V,这样子电流只有一百多毫安,差不多也就是五十多KD的蛋白;背景高的话可以加大脱脂奶粉的浓度,用7.5%的,另外脱脂奶粉里可以再加入0.5%的二抗来源动物的血清,漂洗要彻底,TBST 10min 4次.不知你用的是哪个公司的抗体,我的一抗一般都是1:2000-1:5000,可能你抗体浓度也高了,但是你的目的条带并不清楚,所以也不敢确定.你可以尝试改一下条件,如果还不好的话,很有可能是你抗体的原因了.
WB就是很奇怪,一次做出来不一定次次都能出来
WB就是很奇怪,一次做出来不一定次次都能出来
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帮我看看我的western blot条带吧.
western blot条带问题,高手请进
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