流式细胞术本实验室有bdC6,我想做TH1/TH2检测,用IFN-γ-FITC,IL-4-eFluor660,CD3-P
来源:学生作业帮 编辑:大师作文网作业帮 分类:综合作业 时间:2024/10/02 16:16:29
流式细胞术
本实验室有bdC6,我想做TH1/TH2检测,用IFN-γ-FITC,IL-4-eFluor660,CD3-PE,CD8-PE-Cy7.
本实验室有bdC6,我想做TH1/TH2检测,用IFN-γ-FITC,IL-4-eFluor660,CD3-PE,CD8-PE-Cy7.
童鞋你这是个100分问题啊亲.
BD Accuri C6 我没有用过,我找到的laser和filter信息如下,假定你用的是标准配置(红框内)
你挑选的4个荧光已经分布到4个不同的通道,貌似可以共染色然后同时读取.具体有一些特别注意的地方分析如下:
1.efluor660的发射光谱同670LP filter的波段有严重重叠但是因为FL3和FL4由不同laser激发,我认为不会造成问题.
2.FITC与PE-Cy7都会有信号泄露到FL2 PE的通道.FITC与PE的共染色是常见的,compensation必做,可以解决问题.但考虑到它们全用同一个laser,这里PE激发效率本来也只有50-60%,PE-Cy7又是一个效率不高的tandem dye,恐怕会泄露过来很多PE信号.这种情况下,我真的不知道能否靠compensation来解决问题.
建议是楼主只做PE与PE-Cy7的双染色预实验(需要空白及两种单染色对照),测试compensation的效果.如果没问题可以实施原本实验计划.
当然,如果楼主抗体还没有买好,还能改荧光,我建议买CD8-PerCP,直接不用做PE对它的compensation了啊啊啊啊啊.
以上是个人在理论上的理解,实际经验并不太多,欢迎网友指正.
以上光谱来自于ebioscience FluorPlan Spectra Viewer.
再问: 抗体我还没买,但是我找不到大鼠CD8-PerCP抗体,有其它别的抗体可以用吗?找到一个大鼠抗percp-eflour710,可以用吗,谢谢.
再答: 从波谱来看percp-efluor710激发得很好,发射峰也更靠右,应该是比percp更好的选择。只是我没有用过tandem dyes所以没有想到用它。但我也不知道tandem dye是否有什么缺点。
再问: CD3和CD8需要做同型对照吗?为什么呢
再答: 理论上来说,所有的抗体都需要做同型对照。原因也是由于相同的原因,摆渡百科有讲: 同型对照 同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的,而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。还可以用来竞争性的结合抗体,与功能阻断抗体发挥同样的功能。 同型对照要与一抗的来源,Ig分型和标记完全一致。 他其实更详细的,但太长,有兴趣你自己去看一下。 实际操作中来说,确实每次实验都做要耗费很多样本与试剂。我建议一个折中的办法就是对于某个特定的样本类型,做一次完整的同型对照,确定一下同型对照与完全不染色的空白对照样本结果一致,则在同类的实验当中,在保持一致的染色操作前提下,可以考虑以后使用不染色的空白对照作为对照。但是,如果同型对照确实含有一定的背景信号,比不染色的空白对照波峰有右移,则每次实验都做同型对照是不能够省掉的。但是再但是一下,考虑到你的CD3和CD8是高表达的分型marker,也就是说阳性群与阴性群将会有明显的分离,也就是说,你的实验组本身就带有自己的完美的对照(样本中的阴性细胞,比如你使用外周血单核细胞,就一定含有CD3-CD8-细胞)。不管你的同型对照做不做,你都不会遇到任何困难gate出你要的CD3+CD8+细胞群。所以,我认为对这两个抗体做不做同型对照不会影响你的结果,当然前提是你的染色条件适宜。但是对于其他抗体,需要精细地区分阳性和阴性,两者之间没有分界而是连续分布,则同型对照就非常重要。
BD Accuri C6 我没有用过,我找到的laser和filter信息如下,假定你用的是标准配置(红框内)
你挑选的4个荧光已经分布到4个不同的通道,貌似可以共染色然后同时读取.具体有一些特别注意的地方分析如下:
1.efluor660的发射光谱同670LP filter的波段有严重重叠但是因为FL3和FL4由不同laser激发,我认为不会造成问题.
2.FITC与PE-Cy7都会有信号泄露到FL2 PE的通道.FITC与PE的共染色是常见的,compensation必做,可以解决问题.但考虑到它们全用同一个laser,这里PE激发效率本来也只有50-60%,PE-Cy7又是一个效率不高的tandem dye,恐怕会泄露过来很多PE信号.这种情况下,我真的不知道能否靠compensation来解决问题.
建议是楼主只做PE与PE-Cy7的双染色预实验(需要空白及两种单染色对照),测试compensation的效果.如果没问题可以实施原本实验计划.
当然,如果楼主抗体还没有买好,还能改荧光,我建议买CD8-PerCP,直接不用做PE对它的compensation了啊啊啊啊啊.
以上是个人在理论上的理解,实际经验并不太多,欢迎网友指正.
以上光谱来自于ebioscience FluorPlan Spectra Viewer.
再问: 抗体我还没买,但是我找不到大鼠CD8-PerCP抗体,有其它别的抗体可以用吗?找到一个大鼠抗percp-eflour710,可以用吗,谢谢.
再答: 从波谱来看percp-efluor710激发得很好,发射峰也更靠右,应该是比percp更好的选择。只是我没有用过tandem dyes所以没有想到用它。但我也不知道tandem dye是否有什么缺点。
再问: CD3和CD8需要做同型对照吗?为什么呢
再答: 理论上来说,所有的抗体都需要做同型对照。原因也是由于相同的原因,摆渡百科有讲: 同型对照 同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的,而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。还可以用来竞争性的结合抗体,与功能阻断抗体发挥同样的功能。 同型对照要与一抗的来源,Ig分型和标记完全一致。 他其实更详细的,但太长,有兴趣你自己去看一下。 实际操作中来说,确实每次实验都做要耗费很多样本与试剂。我建议一个折中的办法就是对于某个特定的样本类型,做一次完整的同型对照,确定一下同型对照与完全不染色的空白对照样本结果一致,则在同类的实验当中,在保持一致的染色操作前提下,可以考虑以后使用不染色的空白对照作为对照。但是,如果同型对照确实含有一定的背景信号,比不染色的空白对照波峰有右移,则每次实验都做同型对照是不能够省掉的。但是再但是一下,考虑到你的CD3和CD8是高表达的分型marker,也就是说阳性群与阴性群将会有明显的分离,也就是说,你的实验组本身就带有自己的完美的对照(样本中的阴性细胞,比如你使用外周血单核细胞,就一定含有CD3-CD8-细胞)。不管你的同型对照做不做,你都不会遇到任何困难gate出你要的CD3+CD8+细胞群。所以,我认为对这两个抗体做不做同型对照不会影响你的结果,当然前提是你的染色条件适宜。但是对于其他抗体,需要精细地区分阳性和阴性,两者之间没有分界而是连续分布,则同型对照就非常重要。
流式细胞术本实验室有bdC6,我想做TH1/TH2检测,用IFN-γ-FITC,IL-4-eFluor660,CD3-P
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谁有各种细胞的CD Marker(主要是白细胞的),比如DC Cell、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、Th1、Th2等?
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