反转录RT-PCR的内参如何选择?

来源：学生作业帮编辑：大师作文网作业帮分类：生物作业时间：2024/11/10 22:06:58

反转录RT-PCR的内参如何选择?

RT-PCR就是将RNA先反转录为cDNA,在将转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应扩增目标片段.用于反转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异引物的一种.对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA三种都可.
随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的转录反应.主要用于单一模板的RT-PCR反应.
Oligo dT：适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴.）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少.
基因特异引物：与模板序列互补,适用于目的序列已知的情况.
实时PCR也就是qPCR的基本原理与PCR也是一样的,只是在体系中加入荧光指示,可以对PCR的模板进行定量.
一种是加入荧光染料SYBR Green,SYBR Green会嵌入双链DNA的小沟,且只有在嵌入小沟时才会发出荧光,荧光定量PCR没进行一个循环就会对产物进行一次检测,通过检测每个循环后荧光强度（间接得知DNA的量）从而检测整个PCR的过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析.SYBR Green不具有特异性,对结果稍有影响.
另一种是加入荧光探针Taq man,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时,Taqman探针在PCR体系中会与目标片段杂交,而在PCR的Extension阶段Taq酶以一条链为模板合成目标片段,此时Taq酶的5'－3'外切酶活性将结合在模板上的探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.Taq man 特异性强,只有被扩增出目标片段时,才有荧光发出,但是价格昂贵.

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